“Production of Resveratrol in Recombinant Microorganisms”

BAB I

PENDAHULUAN

 

1.1              Latar Belakang

Resveratrol (3,5,4-transhydroxystilbene) adalah salah satu senyawa polifenol yang terdapat pada tumbuhan dan dimanfaatkan dalam bidang medis dan sudah banyak penelitian yang dilakukan. Resveratrol adalah polifenol utama yang ditemukan dalam anggur merah. Resveratrol merupakan antioksidan. Antioksidan membantu dalam mengurangi kerusakan oksidatif dalam tubuh. Merupakan jenis kerusakan yang disebabkan oleh radikal oksigen bebas di dalam tubuh. Radikal bebas menyerang molekul melalui elektron dan selanjutnya mengubah struktur kimia. Senyawa tersebut digolongkan sebagai senyawa fitoaleksin, yaitu senyawa yang dihasilkan tanaman sebagai respon terhadap masuknya patogen atau penyakit. Senyawa ini terdapat dalam kandungan anggur merah. Diambil dari komponen kulit anggur (sampai 0,1%), diolah dan diekstraksi, bersama sama dengan pewarna anthocyanin, selama proses fermentasi pembuatan anggur merah. Anggur merah memiliki efek baik bagi kesehatan karena memiliki kandungan konsentrasi polyphenol yang tinggi, termasuk resveratrol. Sejumlah penelitian telah membuktikan bahwa Resveratrol memberikan dampak/efek yang baik pada manusia, termasuk efek anti kanker dan mengurangi kolesterol jahat atau lipoproteion densitas rendah, melindungi jantung, dan mencegah berbagai penyakit yang berkaitan dengan umur, seperti diabetes, inflamasi, penyakit neurodegeneratif, dan penyakit kardiovaskular. Dalam penelitian ini resveratrol diproduksi dalam sistem mikroba, sebagai alternatif untuk ekstraksi dari tanaman atau bahan kimia sintesis. Oleh karena itu saya menulis makalah ini yang diambil dari jurnal “Production of Resveratrol in Recombinant Microorganisms” agar para pembaca dapat mengetahui manfaat dari resveratrol, cara memproduksi dan mau mengkosumsinya sebagai bahan pangan dan untuk kesehatan.

 

BAB II

PEMBAHASAN

 

Pada tumbuhan, resveratrol diproduksi sebagai cabang dari fenilpropanoid. Berasal dari asam p-coumaric, yang merupakan intermediate dalam produksi lignin. Dengan aksi 4-coumarate: koenzim A (CoA) ligase (4CL) (EC 6.2.1.12), itu diubah menjadi coumaroyl-KoA. Coumaroyl-CoA dan tiga unit malonyl-CoA yang diringkas menjadi resveratrol oleh  enzim sintase stilben (STS) (EC 2.3.1.95) (Gbr. 1).

Keterangan  (Gbr. 1). Jalur biosintesis resveratrol. Biosintesis resveratrol dimulai oleh kopling asam p-coumaric untuk KoA oleh enzim 4CL. Selanjutnya, coumaroyl-KoA diubah menjadi resveratrol dengan penambahan berurutan dari tiga unit malonyl-KoA dengan rilis karbon dioksida

Bahan dan Metode

Gen 4CL2 (Gen Bank aksesi No.U50846.) diperkuat dari cDNA yang diperoleh dari daun muda yang terluka dari cv Nicotiana tabacum. Samsun dengan menggunakan oligonukleotida 5’-TATACCATGGAGAAAGATACAAAACAGG dan 5’GCGGCCGCTTAATTTGGAAGCCCAGCAG. Yang diperkuat fragmen diklon ke vektor pACYC-DUET1 (Novagen) dengan menggunakan enzim restriksi NcoI dan NotI. Selanjutnya gen STS dari Vitis vinifera diamplifikasi dari plasmid HEAP25 dengan menggunakan oligonukleotida 5’-ATATAGATCTGGCTTCAGTCGAGGAAATTAGAAAC dan 5’-ATATACTCGAGCTTAATTTGTAACCATAGGAATGC. Fragmen amplifikasi yang diperkenalkan ke pACYC-DUET1-4CL dengan menggunakan enzim resrtiksi BglII dan XhoI. Plasmid yang dihasilkan, PAC-4CLSTS, dipindahkan ke Escherichia coli BL21. Kemudian culture  strain ini ditumbuhkan pada medium YT (10 g / liter ragi ekstrak, 16 g / liter Trypton, 5 g / liter NaCl) pada suhu 28 ° C dan 250 rpm dalam 100 ml, dilengkapi dengan 5 mM asam p-coumaric (Sigma) dan 0,1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside). Setelah 24 jam pertumbuhan, culture diekstraksi dengan etil asetat, dan high-pressure liquid chromatography (HPLC) digunakan untuk analisis ekstrak untuk menunjukkan akumulasi suatu senyawa dengan λ maksimum 305 nm dan elusi pada 28,9 menit dalam medium kultur (Gbr. 2).

HASIl

Keterangan  (Gbr. 2). analisis HPLC pada resveratrol yang diproduksi oleh E. coli pada 307 nm. Kromatogram (A) berasal dari ekstrak kultur E. coli BL21 ditambah PAC-4CL-STS tumbuh dengan asam p-coumaric selama 20 h. Medium kultur dipisahkan oleh HPLC setup, dan absorbansi tercatat sebesar 307 nm. Kromatogram (B) menunjukkan hal yang sama untuk kontrol E. coli BL21 ditambah pACYC-DUET1. Puncak pada menit ke-17 merupakan asam p-coumaric, dan puncak pada menit ke-28,9 merupakan resveratrol. Spektrum penyerapan puncak pada menit ke-28,9 ditampilkan dalam inset “PDA”, sedangkan spektrum massa, direkam dengan spektrometer massa Ultima QTOF (elektrospray mode ionisasi negatif) dan ditampilkan dalam inset “MS”.

Antara waktu penyerapan spektrum dan waktu retensi ini berhubungan dengan  standar senyawa resveratrol (Sigma). Identifikasi lebih lanjut menggunakan mass spectrometry diungkapkan bahwa senyawa ini memiliki sebuah m/z value of 227.07 [M-H]¯,
dengan demikian dapat dikonfirmasi bahwa produk tersebut adalah resveratrol (Gbr.
2).

Pembentukan resveratrol diikuti dengan analisis HPLC denga sampel sebanyak 5-ml selama pertumbuhan kultur (Gambar 3A

Keterangan  (Gbr. 3A). Produksi resveratrol dalam E. coli (A) dan S. Cerevisiae (B) dari waktu ke waktu. Setiap grafik menampilkan konsentrasi resveratrol dalam mg / liter pada medium kultur yang diukur setelah ekstraksi, konsentrasi asam p-coumaric (p-CA) dalam g / liter, dan densitas dari kultur (tidak ada nilai absolut ditunjukkan). Nilai yang ditampilkan adalah rata-rata dari dua pengukuran kultur.

Selama pertumbuhan sel logaritmik (hingga 24 jam), jumlah resveratrol meningkat menjadi 12 sampai 20 mg / liter, sedangkan konsentrasi asam p-coumaric menurun menjadi 0,2 mM setelah 20 h. Fase berikutnya yaitu stasioner, baik konsentrasi resveratrol dan asam p-coumaric mengalami penurun pada tingkat yang tidak terdeteksi.

Sebagai langkah berikutnya menuju sistem produksi pangan yang lebih baik, kami mengungkapkan gen yang sama di Saccharomyces cerevisiae. Untuk tujuan tersebut, gen 4CL2 dan gen STS digabung menjadi sebuah konstruksi yang dapat diintegrasikan ke dalam lokus yeast LEU2 (Gbr. 4).

Penggabungan-pemilihan-perubahan

Gambar. 4. Kaset untuk integrasi STS dan 4CL ke dalam genom ragi. LEU21-546, gen LEU2 dari nukleotida 1-546 dari daerah pengkode; Pi, promotor dari gen ILV2; ILV2-SMR, sulfometuron metil gen resistensi, Ti, terminator dari gen ILV2, Tc, terminator dari gen CYC; STS, daerah pengkode gen anggur STS; PGAL1, promotor dari gen GAL1; PGAL10, promotor dari gen GAL10; 4CL, daerah pengkode gen 4CL2 dari tembakau; Ta, terminator dari gen ADH1; LEU2547-1060, gen LEU2 dari nukleotida 547-1060 dari daerah pengkode; paci, unik paci pembatasan situs.

Dalam kontruksi tersebut, gen 4CL berada di bawah kendali promotor GAL10, sedangkan gen STS berada di bawah kendali promotor GAL1. Setelah transformasi yeast  strain CEN.PK 113-3b (ura3 his3), integrasi diseleksi menggunakan 25 mg/liter chlorsulfuron metil (Supelco) dan dikonfirmasi dengan analisis PCR. Culture dari rekombinan koloni yeast ditumbuhkan di tabung media yang berisi 50 ml base nitrogen yeast (28°C, 250rpm), dilengkapi dengan 5 mM asam p-coumaric dan 2% galaktosa untuk menginduksi ekspresi gen. Ekspresi gen berlangsung selama beberapa hari, sementara sampel 5-ml diambil secara teratur dan dianalisis dengan HPLC. Dalam STS-positif klon yeast, resveratrol diamati menumpuk dari waktu ke waktu (Gambar 3B

Keterangan  (Gbr. 3B). Produksi resveratrol dalam E. coli (A) dan S. Cerevisiae (B) dari waktu ke waktu. Setiap grafik menampilkan konsentrasi resveratrol dalam mg / liter pada medium kultur yang diukur setelah ekstraksi, konsentrasi asam p-coumaric (p-CA) dalam g / liter, dan densitas dari budaya (tidak ada nilai absolut ditunjukkan). Nilai yang ditampilkan adalah rata-rata
dari dua pengukuran kultur.

Setelah 24 jam, pertumbuhan kultur sel mulai menjadi tinggi. Tidak seperti pada E. coli, jumlah resveratrol meningkat selama fase stationary , menjadi sekitar 5,8 mg / liter (sesuai dengan 25 µM) pada 96 jam. Sementara di E. coli tidak diamati pembentukan produk yang signifikan di medium yeast , hasil HPLC yang maksimal yaitu (Rf = 15.1 min, λmax = 273 nm) dan ditemukan terjadi pertumbuhan pada tahap selanjutnya. Senyawa Ini diidentifikasi sebagai asam hidroksifenil-propionat (Gbr. 1) bila dibandingkan dengan standar referensi dan massa spektrometri ([M-H]¯=165.0559 m /z). Konsentrasi senyawa ini meningkat sampai 3 mM. Sintesis ini tampaknya tergantung pada keberadaan 4CL-STS sebagai konsep ekspresi, karena puncak ini tidak muncul dalam kultur yeast untransformed ketika diinkubasi dengan asam p-coumaric.

Data dari laporan yang baru baru ini  menunjukkan bahwa dalam yeast, resveratrol  diproduksi terutama dalam bentuk piceid (trans-resveratrol 3-O-β-glukosida) meskipun dalam jumlah menit. Namun, pada waktu retensi dari senyawa piceid tidak  diamati dalam medium atau sel ragi strain transgenik. Inkubasi kultur medium atau lisat sel ragi dengan  almond β-glucosidase (Sigma) tidak terdeteksi mengakibatkan peningkatan  jumlah aglikon resveratrol. Selain itu, dalam  sistem kami, tingkat resveratrol unglucosylated lebih tinggi dari 3kali lipat (5,8 mg / liter) dibandingkan tingkat  piceid yang dilaporkan sebelumnya untuk ragi (1,5µ g / liter [1]).

Dalam beberapa tahun terakhir, sejumlah hasil dari penelitian telah dipublikasikan  produksi dalam mikroorganisme dari tanaman yang  spesifik  mempunyai polifenol, terutama naringenin, untuk tingkat yang berbeda (0,45 mg / liter [3], 7 mg / liter [4], dan 20 mg / liter [10]). Dari sebuah laporan pada produksi resveratrol dalam E. coli dengan menggunakan gen dari kacang tanah dihasilkan enzim STS muncul. Data kami  menunjukkan bahwa ekspresi platform ragi rekombinan, menggunakan  gen biosintesis yang sama, sudah efisien daripada E. coli. Dengan demikian, yeast mampu menghasilkan resveratrol  tingkat tinggi dari tanaman yang diturunkan dari prekursor. Keuntungan dari yeast dibandingkan dengan  E.coli adalah statusnya food grade, pada prinsipnya memungkinkan untuk dimanfaatkan dalam aplikasi gizi manusia.

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s