macam macam teknik pelabelan antibodi pada ELISA

 

1.    Teknik ELISA kompetitif

Teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat  antibodi-enzim.

  • Prinsip dasar dari teknik ini adalah :

dengan menambahkan  suatu kompetitor ke dalam lubang  microtiter. Teknik ELISA kompetitif ini  dapat diaplikasikan untuk mendeteksi  keberadaan antigen maupun antibodi.  Pada pendeteksian antigen, pertama microtiter diisi antibodi spesifik yang  dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik tertaut enzim signal, sehingga antibodi spesifik tersebut dapat menempel pada bagian  dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang  antibodi spesifik yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu  larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim  signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen  spesifik tertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat  berinteraksi dengan antibodi spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen  yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Lalu, kedalam lubang-lubang  microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal  yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen  yang telah berinteraksi dengan antibodi spesifik akan bereaksi dengan substrat dan  menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini,  pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang  berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen  spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibodi spesifik.  Sedangkan, pada pendeteksian antibodi, pertama microtiter diisi antigen  spesifik yang dapat berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan maupun  antibodi spesifik tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat  menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter  dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dinding  lubang microtiter. Lalu larutan yang mengandung antibodi spesifik yang telah  ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibodi  yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi  kompetisi antara antibodi spesifik tertaut enzim signal dengan antibodi yang  diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan  dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi spesifik tertaut enzim  signal atau antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu,  kedalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat  bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibodi spesifik, sehingga enzim  yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antibodi yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik

  • Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya  purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen

 

  • 2.    Teknik ELISA nonkompetitif / ELISA Sandwich

Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua  (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.  Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA  sandwich.

  • Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA  direct, hanya saja pada ELISA sandwich,  larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.
  • Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan  untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi. Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi detektor, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi detektor yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi
  • Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang microtiter dan Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen  Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari  teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct.
  • Kelebihan teknik ELISA sandwich

ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi  karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi,  yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA  sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

3.    ELISA Direct

Teknik ELISA ini merupakan  teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan untuk  mendeteksi dan mengukur konsentrasi  antigen pada sampel. ELISA direct  menggunakan suatu antibodi spesifik  (monoklonal)  untuk  mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

  • Prinsip kerja Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang  mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel  pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk  membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu  antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang- lubang microtiter sehingga antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke  dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi  dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah  berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan  menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi  dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan  kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
  • ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
  1. Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.
  2. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
  3. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan yang berbeda.
  4. Amplifikasi signal hanya sedikit.
  5. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct
  • Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:
  1. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi
  2. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi

 

 4.    ELISA Indirect

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA  yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi  dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.

  • Prinsip Kerja :

Pada ELISA indirect, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu, ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

  • ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain:

Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA  direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal.

  • Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain:

1.Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual bebas.

  1. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak  terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada wadah berbeda.
  2. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder

 

5.    ELISA Biotin Streptavidin (Jenis ELISA modern)

Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga  dikembangkan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibodi, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan pada teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detektor (antigen bertaut enzim signal, bersifat optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut dengan enzim signal).

  • Contoh dari aplikasi teknik ini  adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang tertaut dengan suatu antibodi avidin dengan mengubah antibodi avidin menjadi antibodi streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak

 

 6.      ELISA Multiplex

teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian secara simultan, sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.

 

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s